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Clotrimazol hemmt die Synthese von Ergosterol, einem essentiellen Bestandteil der Zellmembran von Pilzen. Durch die Hemmung des Enzyms 24-Methylen- hydroanosterol kann die Zelle aus Lanosterol kein Desmethylsterol und folglich kein Ergosterol aufbauen. Fehlt dieser wichtige Baustein, dann kommt es zu einer Schädigung der Zellmembran, zu einem Austritt von Zellinhalt

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und damit zur Zerstörung des Pilzes. Clotrimazol hat damit einen idealen Angriffpunkt bei allen Pilzen, die beim Menschen Hautinfektionen auslösen können, da sie alle von Ergosterol abhängig sind.

Die Wirkungsweise von Clotrimazol ist konzentrationsabhängig. Bei niedriger Konzentration wirkt es fungistatisch. Es kommt nur zu einer Hemmung des Pilzwachstums. Die Pilze können sich damit nicht weiter ausbreiten. In höheren Konzentrationen von 10-20 mg/l, wie sie bei lokaler Behandlung in den oberen Hautschichten erreicht werden, wirkt es sogar fungizid. Es kommt dann zu einer direkten Abtötung der Pilze.

Zusätzlich soll Clotrimazol das Einnisten von Hefesprossen in das Gewebe vermindern, die sich dort zu einem späteren Zeitpunkt vermehren würden. Durch Clotrimazol kann es zu einer Stimulation des Immunsystems kommen, was die Behandlung unterstützen würde.